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PCR 伟德国际官网中文的潜在污染来源



①临床标本中存在的大量待测微生物或待测靶核酸


②科研中得到的质粒克隆


③以前分析研究的特定微生物或靶核酸


④大量存在于实验环境中的特定微生物或靶核酸


⑤以前扩增产物的残留污染,这也是 PCR 伟德国际官网中文容易产生的将造成假阳性的“污染”。 


PCR扩增可以引起伟德国际官网中文中扩增产物的累积,通常一次典型的PCR 扩增可以产生109拷贝的靶序列,如果气溶胶化,甚至小的气溶胶都会含有106拷贝的扩增产物。如果不加以控制,在短期内累积的气溶胶化的扩增产物即会污染伟德国际官网中文中的试剂、仪器设备和通风系统,从而造成严重的伟德国际官网中文“污染”,出现大量的假阳性结果。


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▶PCR 伟德国际官网中文的防污染措施◀


进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,大程度地降低可能出现的PCR污染或以防污染的出现。


(一) 划分操作区



目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:


1.  试剂准备区。


2.标本制备区。


3.  PCR扩增区及分析区。


各工作区要有隔离,操作器材,要有方向性。如:试剂准备→标准制备→PCR扩增区及分析区。


切记:任何一间的产物及器材不要拿到其他两个工作区。


(二) 分装试剂


PCR扩增所需要的试剂均应在生物柜、装有紫外灯的工作台或负压工作台配制和分装。加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA:


1.PCR用水应为高压的双蒸水;


2.引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;


3.引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。


(三) 伟德国际官网中文的严格分区及工作程序的严格遵守


试剂准备区、样本准备区、扩增区、检测区等须备有其各自需要的仪器设备、工作服、手套、加样器和通风系统。在每个区使用的试剂和废物,须直接在其各自的区域内分装或包装。操作人员须注意以防通过他们的头发、眼镜、首饰和衣服将扩增产物从污染区携带至清洁区的可能性。


(四)化学方法


伟德国际1946官方下载面可使用10%的次氯酸钠(漂白剂)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠。次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用,从而使可能的留在伟德国际1946官方下载面的扩增产物被破坏掉。要注意的是,次氯酸钠不能区分提取的目的 DNA 和 PCR 扩增产物,用次氯酸钠处理的样本不能用于核酸扩增检测。在实际工作中,有些物品比如放置扩增反应管的盘须从污染区转回到清洁区时,在转回之前,应将其置于2%~10%的次氯酸钠溶液中过夜,并充分冲洗。


(五)扩增产物的修饰


如对以前扩增产物进行适当修饰,应可以消除其污染后面新的扩增检测,但为不影响靶核酸的扩增检测,扩增产物修饰方法须遵循两个基本原则:


一是扩增产物被修饰后,应可以与随后打增的靶序列区分


二是修饰不能干扰正常的扩增检测。


(六) 实验操作注意事项



尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的环节都应该注意:


1.  戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;


2.  使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;


3.  避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;


4.  操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的准确度;


5.  后加入反应模板,加入后盖紧反应管;


6.  操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可信性,又可以协助判断扩增系统的可信性;


7.  尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种加样器,至少PCR操作过程中加样器不能交叉使用,PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;


8.  重复实验,验证结果,慎下结论。


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▶伟德国际官网中文污染的监测◀

一个好的伟德国际官网中文,要时刻注意污染的监测,考虑有没有污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,预防和消除污染。


对照试验


1、阳性对照:在建立PCR反应伟德国际官网中文及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性  对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳  定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。


2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。


3、重复性试验


4、选择不同区域的引物进行PCR扩增


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▶伟德国际官网中文污染的消除◀


伟德国际官网中文一旦发生污染,检测工作应立即停止,直到确认消除污染后才能重新开始检测。要查找污染源和明确污染范围。然后,根据污染源和污染范围采取去污染措施,结合各种不同方法以达到好效果。


1.标本污染生物柜的操作台造成局限污染时:


立即用吸水纸覆盖,并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配,24小时内使用。


2.标本倾覆造成伟德国际官网中文污染时:


保持伟德国际官网中文空间密闭,避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。需要时(如大量溢撒时)可用过氧乙酸加热熏蒸伟德国际官网中文,剂量为2g/m³,熏蒸过夜;或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾,用量8ml/m³,作用1-2小时;需要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸:高锰酸钾8g/m³,放入耐热耐腐蚀容器(陶罐或玻璃容器),后加入甲醛(40%)10ml/m³,熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。


3.清理污染物时:


严格遵循活病毒生物操作要求,采用压力蒸汽灭菌处理,并进行伟德国际官网中文换气等,以防再次危害。


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▶新冠病毒核酸检测常见问题◀


1、新冠试剂出现翘尾,怎么处理?


答:如果是个别单一通道翘尾,不管是FAM还是VIC通道,先按照要求复查,复查建议重新采样,如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证,如果复查阴性判读阴性,如果复查还是同一通道翘尾,就要对结果仔细审核,一是要排除伟德国际官网中文污染,二是要对病人信息了解清楚,从临床症状及接触史排查,如果没法确认,建议须重新采样复查,如有需要可以采用另一家试剂来验证。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾,主要原因是考虑伟德国际官网中文污染,可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。


2、N基因和1ab基因是新冠病毒的基因吗,灵敏度哪个更高?是否会和其他冠状病毒片段重叠?


答:N基因跟1ab都是特异的,不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。设计时候,两个基因的序列不一样,导致灵敏度不一样,N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。


3、新冠检测结果和临床诊断不符合,怎么解读?


答:新冠病毒由于是RNA病毒,容易降解,另外检测结果也和取样,核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关,需要逐一分析,同时可以结合临床症状判读。


4、采用生理盐水做阴性对照,内标也会增长,怎么解释?


答:因为试剂采用的是内源性内标,内源性内标是用人源基因标记,此基因存在于人的表皮细胞内,操作过程中就可能会出现人源性的污染,另外环境污染也有可能导致内标增长,这也是前面提到的建议做环境样本质控。


5、新冠样本内标不出如何处理?


答:如果新冠样本内标不出,该样本须复查,可重新混匀该样本提取核酸,如果重新提取该样本内标还是不出,在排除提取问题的情况下,说明采样不合格,要通知临床重新采样复查。


6、采集环境样本检测新冠状病毒,为啥大部分样本内标不出,偶尔个别样本检测出内标?


答:因为新冠试剂检测的是人内源性内标,环境样本一般不含有人源细胞,所以检测不出内标;偶尔检出内标,可能该环境样本上有人源性细胞粘附,故而检出内标。


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